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时间:2020-01-28来源:未知作者:admin点击:
[目的要求] 1.掌握差速离心法和密度梯度离心法的原理。 2.熟悉哺乳动物细胞的细胞核、线粒体分离和纯化的实验方法。细胞器的分级分离 [实验原理]球形颗粒的沉降速率取决于

  [目的要求] 1.掌握差速离心法和密度梯度离心法的原理。 2.熟悉哺乳动物细胞的细胞核、线粒体分离和纯化的实验方法。细胞器的分级分离 [实验原理]球形颗粒的沉降速率取决于其密度、半径、介质黏度和离心力。差速离心法(differential centrifugation)是将细胞匀浆在密度均一的介质中从低速到高速离心,较大颗粒先在低速离心时沉淀,再用高速离心沉淀上清液中的小颗粒物质,从而达到逐级分离细胞器的目的。密度梯度离心法(density gradient centrifugation)是一定介质形成一连续或不连续的密度梯度,顶部的细胞匀浆在重力或离心力场的作用下分层、分离。一般先通过差...

  [目的要求] 1.掌握差速离心法和密度梯度离心法的原理。 2.熟悉哺乳动物细胞的细胞核、线粒体分离和纯化的实验方法。细胞器的分级分离 [实验原理]球形颗粒的沉降速率取决于其密度、半径、介质黏度和离心力。差速离心法(differential centrifugation)是将细胞匀浆在密度均一的介质中从低速到高速离心,较大颗粒先在低速离心时沉淀,再用高速离心沉淀上清液中的小颗粒物质,从而达到逐级分离细胞器的目的。密度梯度离心法(density gradient centrifugation)是一定介质形成一连续或不连续的密度梯度,顶部的细胞匀浆在重力或离心力场的作用下分层、分离。一般先通过差速离心法将细胞器初步分离,再进一步通过密度梯度离心法分离纯化细胞器。 细胞器的分离常通过组织细胞匀浆、分级分离和分析三个步骤完成。分级分离方法有两种,即:差速离心法和密度梯度离心法。 [实验用品]1.器具:玻璃匀浆器、低速离心机、高速冷冻离心机、天平、普通光学显微镜、葡京会员开户1.5 ml Ep管、载玻片、10 ml滴管、冰盒、冰块、滤网、染缸、20 ml烧杯。2.材料:大白鼠。3. 试剂:生理盐水、PBS、0.25 mol/L的蔗糖溶液、0.34 mol/L蔗糖-0.5 mmol/L Mg(Ac)2溶液、0.88 mol/L蔗糖-0.5 mmol/L Mg(Ac)2溶液、95%乙醇、甲基绿-派洛宁染液、丙酮、0.2%的詹纳斯绿B。 [实验步骤]1.组织匀浆制备(1)取材 将空腹12~24 h的大鼠处死。剖开腹部,迅速取出肝脏,用预冷的生理盐水洗净血污,用滤纸吸干。(2)制备匀浆 称取约1~2 g左右的肝组织,用预冷的0.25 mol/L的蔗糖溶液冲洗数次,剪碎。以预冷的0.25 mol/L的蔗糖溶液悬浮剪碎的组织,移入匀浆器内,在冰浴条件下匀浆。匀浆完成后,用滤网过滤,即制得肝细胞匀浆,备用。(1)取材 将空腹12~24 h的大鼠处死。剖开腹部,迅速取出肝脏,用预冷的生理盐水洗净血污,用滤纸吸干。(2)制备匀浆 称取约1~2 g左右的肝组织,用预冷的0.25 mol/L的蔗糖溶液冲洗数次,剪碎。以预冷的0.25 mol/L的蔗糖溶液悬浮剪碎的组织,移入匀浆器内,在冰浴条件下匀浆。匀浆完成后,用滤网过滤,即制得肝细胞匀浆,备用。 2.细胞器的分级分离(1)细胞核的分离:第一次:1000rpm,8min。(2)细胞核的纯化在沉淀中加入0.34mo1/L蔗糖-0.5mmol/L Mg(Ac)2至2ml,混悬。用长针头注射器在混悬液下轻轻加入2ml 的0.88mo1/L蔗糖-0.5mmol/L Mg(Ac)2溶液。尽量使两种溶液明显分层。 2000rpm离心8min。加0.25M蔗糖至4ml,混匀(1)细胞核的分离:第一次:1000rpm,8min。(2)细胞核的纯化在沉淀中加入0.34mo1/L蔗糖-0.5mmol/L Mg(Ac)2至2ml,混悬。用长针头注射器在混悬液下轻轻加入2ml 的0.88mo1/L蔗糖-0.5mmol/L Mg(Ac)2溶液。尽量使两种溶液明显分层。 2000rpm离心8min。加0.25M蔗糖至4ml,混匀第二次:1300rpm,8min。弃上清上清保留于试管1.0处重复1次 显微镜下观察结果(3)细胞核鉴定:。分色:快速放入丙酮中,蒸馏水漂洗,擦干水分固定:浸入95%的乙醇溶液5min,晾干染色:滴加甲基绿-派洛宁染液染色15min固定:浸入95%的乙醇溶液5min,晾干染色:滴加甲基绿-派洛宁染液染色15min涂片:在离心后的沉淀中加入几滴PBS,混匀后涂片,空气干燥涂片:在离心后的沉淀中加入几滴PBS,混匀后涂片,空气干燥 (4)线粒体的分离将分离细胞核时收集的上清以10000 g 离心10 min ,将上清移入1.5 ml Ep 管内并置冰上或4℃ ℃冰箱待用。沉淀用冰箱待用。沉淀用0.25 mol/L 的蔗糖溶液重悬后,10000 g 离心10 min ,重复1 次,取沉淀。(2)线粒体的鉴定于洁净载玻片上滴1 滴0.02 %~1 %的詹纳斯绿B染液,用牙签挑取线粒体沉淀均匀涂于染液中,染色染液,用牙签挑取线粒体沉淀均匀涂于染液中,染色5~ ~10 min ,盖上盖玻片,镜检。 [结果与分析]光学显微镜下观察,细胞核经甲基绿-派洛宁染色,DNA呈蓝绿色,核仁和胞质RNA呈红色。观察分析完整细胞核的数量及其比例。线粒体经詹纳斯绿B染色呈亮绿色。溶酶体可用酸性磷酸酶显示法鉴定。光镜下看不到溶酶体的形态特征,但可看到代表溶酶体的棕黑色颗粒或团块。如果分离到的细胞组分符合其形态学及酶学特征,而且没有其他组分的污染,则证明分离操作成功,反之则为失败。光学显微镜下观察,细胞核经甲基绿-派洛宁染色,DNA呈蓝绿色,核仁和胞质RNA呈红色。观察分析完整细胞核的数量及其比例。线粒体经詹纳斯绿B染色呈亮绿色。溶酶体可用酸性磷酸酶显示法鉴定。光镜下看不到溶酶体的形态特征,但可看到代表溶酶体的棕黑色颗粒或团块。如果分离到的细胞组分符合其形态学及酶学特征,而且没有其他组分的污染,则证明分离操作成功,反之则为失败。 [注意事项] 1.组织匀浆时,既要尽可能使细胞完全破碎,又要尽量快速。1.组织匀浆时,既要尽可能使细胞完全破碎,又要尽量快速。 2.在细胞器分离过程中,所有操作应尽可能在1~4℃下进行。2.在细胞器分离过程中,所有操作应尽可能在1~4℃下进行。 3.实验过程应注意保持细胞器的完整性,避免操作过于剧烈。另线粒体进行的是活体染色,要求样品制备好后尽快染色。3.实验过程应注意保持细胞器的完整性,避免操作过于剧烈。另线粒体进行的是活体染色,要求样品制备好后尽快染色。 [作业与思考题] 1.分别在高倍镜和油镜下观察细胞核和线粒体,并绘制其结构图。1.分别在高倍镜和油镜下观察细胞核和线粒体,并绘制其结构图。 2.简述细胞器分级分离的实验原理和主要步骤? 3.实验操作中有哪些关键步骤和因素影响所得细胞器的含量和纯度?3.实验操作中有哪些关键步骤和因素影响所得细胞器的含量和纯度?

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