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时间:2020-01-28来源:未知作者:admin点击:
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  实验七细胞器的分级分离_理化生_高中教育_教育专区。细胞器的分级分离 ? 高等植物叶绿体制备 ? 动物细胞线粒体的分离 实验目的 ? 学习分离细胞器的一般原理及方法 实验原理 ? 细胞内不同细胞器的比重和大小都不相同, 在均匀密度介质中不同离心

  细胞器的分级分离 ? 高等植物叶绿体制备 ? 动物细胞线粒体的分离 实验目的 ? 学习分离细胞器的一般原理及方法 实验原理 ? 细胞内不同细胞器的比重和大小都不相同, 在均匀密度介质中不同离心力下沉降的细胞 器组成不同或在梯度介质中离心后分布于不 同密度层,根据这一原理,差速离心法或密 度梯度离心法就可将细胞内各种组分分离出 来。 ? 分离流程: 破碎组织(匀浆或研磨)-差速离心或密度 梯度离心分离细胞器-结果检验分析 匀浆(Homogenization) ? 低温条件下,将组织放在匀浆器中,加入等 渗匀浆介质(即0.25mol/L蔗糖一 0.003mol/L氯化钙)进行破碎细胞使之成 为各种细胞器及其包含物的匀浆。 各种匀浆、研磨器 差速离心分级分离(Fractionation) ? 由低速到高速离心逐渐沉降细胞器。 ? 先用低速使较大的颗粒沉淀,再用较高的转 速将上清液中的小颗粒沉淀下来。 Differential centrifugation ? High speed Low speed 密度梯度离心(density gradient centrifugation method ) ? 亦称平衡密度梯度离心法。 ? 用超速离心机对小分子物质溶液,长时间加 一个离心力场达到沉降平衡,在沉降池内从 液面到底部出现一定的密度梯度。 ? 若在该溶液里加入少量大分子溶液,则溶液 内比溶剂密度大的部分就产生大分子沉降, 比溶剂密度小的部分就会上浮,最后在重力 和浮力平衡的位置,集聚形成大分子带状物。 Velocity (A) and Equilibrium (B) sedimentation 分析 ? 分级分离得到的组分,可用细胞化学和生化 方法进行形态和功能鉴定。 (一)实 验材料 ? 多叶绿菜 实 验试剂 ? 0.4M蔗糖 ? 0.35M氯化钠(每升19.856g氯化钠) 实 验用品 1、普通台式离心机:4台 2、研钵:30个 3、40ml小烧杯:30个 4、纱布:5包 5、离心管60支 6、载玻片及盖玻片见指导。 一、叶绿体的分离 细胞中及匀浆中的叶绿体 叶绿体的分离步骤 1、采样、洗涤、去叶脉:最好在晴天上午10时左 右选取生长正常的菠菜叶子(菜心、白菜、豌 豆也可)洗干净,用吸水纸擦干,去柄及粗脉 2、预冷:放入4℃冰箱预冷1h; 3、研磨匀浆:称2克叶子在玻璃研钵中剪碎,先 加1-2m1制备液,快速磨成匀浆,然后再加 8m1制备液,磨匀; 4、过滤:把匀浆液倒在6层沙布上过滤入小烧杯; 5、离心去完整细胞、细胞核等:上述滤液转入 10ml离心管,平衡后在约500rpm(每分钟的 转速)离心2分钟,上清转入另一离心管; 6、离心收集叶绿体:上清液在2600rpm离心5分 钟,弃上清液,沉淀即是叶绿体。 7、悬浮叶绿体:沉淀中加入制备液适量,用吸管吹 打悬浮、葡京会员开户混匀: 8、镜检分离效果 9、叶绿体被膜完整度的测定 :铁氰化钾光还原的 Hill反应 叶绿体的分离应该注意哪些问题? 1、选材 2、低温 3、缓冲系统:渗透压、PH、防氧化 4、研磨程度 5、离心速度